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Protistas Patógenos asociados a Himenopteros polinizadores en la Región Pampeana

Por Santiago Plischuk Lic. en Biología del Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores
CEPAVE (CONICET-UNLP)  para Apicultura sin Fronteras y Noticias Apicolas.com.ar

El orden Hymenoptera se halla distribuido en todo el mundo. Una de sus superfamilias, Apoidea, contiene numerosos miembros que habitan en la región Pampeana de nuestro país, siendo los mas destacados la abeja Apis mellifera y los abejorros de los géneros Bombus, Xilocopa y Megachile, entre otros.

Todos ellos tienen como denominador común el carácter polinizador y si bien A. mellifera se considera el insecto polinizador por excelencia, los abejorros son imprescindibles para la polinización de flores con estructuras inadecuadas para el accionar de las abejas. Se han realizado estudios ponderando el valor de los mismos en cultivos de alfalfa, tomate, trébol rojo, girasol, arándanos, etc. Al mismo tiempo, es bien conocida la facultad de A. mellifera de producir y almacenar cantidades abundantes de miel, característica susceptible de explotarse en mayor o menor medida por el hombre. De hecho, actualmente, Argentina alterna entre los primeros tres lugares en la producción mundial de miel de abejas.

Por consiguiente, lograr una calidad sanitaria óptima de estos himenópteros reviste una gran importancia para sostener, e incluso aumentar los niveles de producción nacionales, tanto de tomate, frutas y forrajeras, como de miel, cera y  propóleos. La primera etapa hacia tal logro es obtener un conocimiento acabado con respecto a su situación sanitaria actual en nuestro país. En este sentido, los protistas o protozoarios (organismos unicelulares eucariotas) son responsables de una serie de enfermedades que pueden tener gran impacto negativo a nivel individual y colonial.

En este contexto, dentro de nuestro país solo se ha constatado la presencia de Nosema sp (Cornejo & Rossi, 1974), pero poco se sabe acerca de su filiación específica (Nosema apis o Nosema ceranae), distribución o patogenias. De hecho, las enfermedades de etiología “protista” suelen ser de tendencia crónica y debilitativa, por lo cual es frecuente que pasen desapercibidas o sean mal diagnosticadas por el inexperto e indebidamente tratadas.

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Desde principios del año 2006, en el Centro de Estudios Parasitológicos y de Vectores –CEPAVE, dependiente del CONICET y de la Universidad Nacional de La Plata- se comenzó a efectuar estudios tendientes a arrojar luz sobre la identificación de estos organismos y sus características epizootiológicas. El mismo está siendo realizado por quien escribe, Santiago PLISCHUK, Licenciado en biología, y dirigido por el Dr. Carlos E. LANGE, investigador de la Comisión de Investigaciones Científicas (CIC) de la provincia de Buenos Aires, de amplia trayectoria dentro y fuera del país en estudios acerca de patógenos asociados a ortópteros (tucuras, langostas, grillos) y blatarios (cucarachas).

El citado plan posee como principal objetivo obtener y analizar información epizootiológica cuali y cuantitativa respecto de las enfermedades infecciosas de etiología “protista”, que se encuentren afectando a himenópteros polinizadores de la superfamilia Apoidea en la región Pampeana. Tal información resultará instrumental para alcanzar el objetivo general a largo plazo, no necesariamente incluido en la propuesta: la optimización de las estrategias de control (cronogramas de medicación, manejo adecuado, profilaxis) de dichas dolencias, algunas de las cuales son de considerable impacto en las poblaciones.

Como objetivos particulares se han propuesto:

 

a) Evaluar la dinámica del microsporidio Nosema sp. en abejas de la región Pampeana, determinando su presencia/ausencia, valores de prevalencia, y realizando curvas de esporulación anuales en diferentes zonas de la misma. Correlacionar las curvas de esporulación obtenidas con los factores abióticos locales (climáticos, edáficos, etc.). Comparar entre sí las curvas de esporulación zonales, a fin de establecer patrones o tendencias de comportamiento de la enfermedad en diferentes zonas de la región.

b) Determinar mediante técnicas moleculares la existencia o no, de las especies Nosema apis y Nosema ceranae en Argentina.

c) Detectar la eventual presencia de otros protistas patógenos en Apis mellifera y, en caso positivo, identificarlos.

d) Prospectar y registrar protistas patógenos en otros himenópteros polinizadores.

e) Explorar la factibilidad de que himenópteros silvestres actúen como posibles reservorios de protistas entomopatógenos, los cuales pudieran afectar a especies domesticadas, en especial a A. mellifera. Recíprocamente, explorar la posibilidad de que protistas introducidos con A. mellifera puedan estar afectando a himenópteros silvestres nativos.

 

ACTIVIDADES Y METODOLOGIA:

 

Área de estudio y toma de muestras:

 

Siguiendo las técnicas clásicas de captura (L’Arrivee, 1963; Cantwell, 1974; Fries, 1988; Bailey & Ball, 1991), se obtienen muestras representativas de abejas y abejorros tomadas de distintas localidades de la región Pampeana. A fines prácticos se dividió la misma en 5 Zonas (Sudoeste, Sudeste, Noroeste, Noreste, y Centro)

Los muestreos se efectúan regularmente realizando un seguimiento o monitoreo de los apiarios elegidos y se llevan registros de los datos relevantes, tanto de las colmenas analizadas como del colmenar en general. El transporte y la conservación de las muestras hasta su procesamiento se realiza en alcohol 70° o, preferentemente, congeladas (-32 °C).

Para el muestreo de abejas se colecta un mínimo de 160 abejas adultas por colmena, garantizando prácticamente la detección de un protista si éste se hallara presente (Fries, 1988). Los muestreos de abejas de panales silvestres y de abejorros se llevan a cabo periódicamente entre fines del invierno y principios del otoño, mediante colectas a campo con redes entomológicas.

 

Obtención de datos climáticos:

 

Se obtienen los registros climáticos mensuales correspondientes a las zonas de donde provengan las muestras, principalmente registro de precipitaciones, temperatura y humedad relativa de cada una de ellas. Se utilizarán como fuente el Servicio Meteorológico Nacional, estaciones experimentales del INTA y aeródromos locales.

 

 

 

Análisis en Laboratorio:

 

Para la detección, aislamiento y estimación de las prevalencias de los protistas se emplea la técnica de homogenización mecánica individual de los insectos en agua bidestilada, y observación de alícuotas de los homogenatos resultantes con microscopía de contraste de fases X400 ó X1000 aumentos (Fries, 1993; Lange & Henry, 1996; Undeen & Vávra, 1997). En ocasiones, se recurre a la técnica clásica de extracción del tracto digestivo entero de las abejas traccionando desde el último segmento abdominal (Cantwell, 1974), como así también disecciones ventrolongitudinales a fin de evaluar el sitio exacto de ubicación del patógeno. Para la cuantificación de esporos se realizan conteos en cámara de Neubauer, siguiendo la técnica de Undeen & Vávra (1997). Este tipo de técnica combinada (homogenización individual / cuantificación en cámara de Neubauer) requiere más tiempo, pero proporciona tanto el porcentaje de abejas parasitadas como el número promedio de esporos por abeja, dando una exactitud que cada una de ellas por separado no brinda. Para la prospección en abejorros también se recurre a técnicas de homogenización, disección y recuentos en Cámara de Neubauer.

 

Análisis molecular:

 

En lo que respecta al análisis molecular de muestras de microsporidios (Nosema spp), se preparan suspensiones esporales purificadas efectuando repetidas filtraciones y centrifugaciones de los homogenatos a analizar (Lange & Henry, 1996; Undeen & Vávra, 1997). Una vez aislados los esporos viables, se lleva a cabo la extracción del material genético (Higes et al., 2006). Para su identificación se recurre a  primers específicos de una región de un gen que codifica el ARNr de la subunidad pequeña ribosomal (16sSSUARNr). Luego de su amplificación por PCR se compara con secuencias patrones, siguiendo la técnica descripta por Higes et al. (2006).

 

Análisis estadísticos:

 

Paralelamente al procesado de los insectos, se llevan los registros de presencia/ausencia de cada tipo protista hallado, así como sus prevalencias locales, zonales y regionales.

Para el caso concreto de Nosema sp en A. mellifera, se confeccionan curvas anuales de esporulación vinculando tanto prevalencias de infección como número promedio de esporos por abeja, ambas en función del tiempo. Se correlacionan estadísticamente estas curvas con los registros climáticos obtenidos a fin de establecer dependencias entre los factores actuantes. Se analizan probables puntos de inflexión causados por eventos concretos individualizables (posibles factores de “stress”) como falta temporal de alimentación o transhumancia de colmenas. Adicionalmente se cuantifican las muestras positivas sobre el total de muestras analizadas, con el objeto de estimar porcentajes de prevalencia de la enfermedad en la región.

En la etapa final del plan, las curvas anuales obtenidas para cada zona se correlacionarán entre sí y con las de las otras zonas, a fin de establecer diferencias o similitudes de comportamiento de la enfermedad en toda la región. En caso de hallarse diferencias, se evaluarán los factores determinantes de la o las variaciones.

 

Resultados preliminares:

 

Detección de Nosema ceranae en Argentina.

 

Los estudios de detección e identificación de este parásito se  llevan a cabo desde el pasado año en un marco cooperativo entre el CEPAVE y el grupo de investigación dirigido por el Dr. Mariano HIGES, del Centro de Investigación Apícola de Marchamalo, España. Las muestras analizadas pertenecen tanto a colmenares como a abejas silvestres, y provienen de colectas propias realizadas entre Abril de 2006 y Julio de 2007.

En este contexto, el uso de técnicas de identificación molecular ha permitido confirmar la existencia de Nosema ceranae en nuestro país, así como la no menos importante ausencia, al menos hasta el momento, de hallazgos de Nosema apis. Este último hecho plantea la necesidad de aumentar el  número de muestras así como de ampliar la zona prospectada, a fin de evaluar las especies de Nosema presentes,  el grado de dispersión de la/s misma/s y la posible relación con síndromes de despoblamiento a lo largo de nuestro país.

 

El citado estudio forma parte de la beca Interna de Postgrado otorgada por el CONICET al Lic. S. Plischuk, así como a su plan de tesis doctoral, ambas dirigidas por el Dr. C. E. Lange y codirigidas por la Dra. A. González.

 

BIBLIOGRAFÍA:

 Bailey L & B. V. Ball. 1991. Honey bee pathology, 2nd ed., Acad. Press, N. Y. 193 pp.

Cantwell G. E. 1974. Honey bee diseases, parasites and pests. En: Insectes Diseases. Vol. II, Cap. 11 (Ed. By G. E. Cantwell), 1974, Marcel Dekker Inc., New York.

Cornejo L. G. & C. O. Rossi. 1974. Enfermedades de las abejas, su profilaxis y prevención. Ed. Ciencia y Abejas. La Plata. Argentina. 176 pp.

Fries I. 1988. Contribution to the study of Nosema disease (Nosema apis Z.) in Honey Bee (Apis mellifera) colonies. Akademisk Avhandling. Sveriges Lantbruksuniversitet. Uppsala.

Fries I. 1993. Nosema apis: A parasite in the Honey bee colony. Bee World 74 (1): 5-19.

Higes M., R. Martín, A. Meana. 2006. Nosema ceranae, a new microsporidian parasite in honeybees in Europe. J. of Inv. Path. 92 (2006) 81-83.

L’Arrivee, J. C. 1963. The Effects of Sampling Sites on Nosema Determination. J. of Ins. Path. 5:349-355.

Lange, C. E. & J. E. Henry. 1996. Métodos de estudio y producción de protistas entomopatógenos. En: Microorganismos patógenos empleados en el control microbiano de plagas. (Lecuona, R. ed.) M. Mas., Bs. As. pp 169-176.

Undeen, H. H. & J. Vávra. 1997. Research methods for entomopathogenic Protozoa. En: Manual of Techniques in Insect Pathology. (Ed. L. Leaney). Acad. Press, San Diego. 117-151.

www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=154163108

 

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